基于肝硬化患者cfDNA肝细胞癌早期检测
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缩略语：Hepatocellularcarcinoma(HCC)；healthycontrols(CTRL)；nucleosomefootprint(NF)；HIFI(5-Hydroxymethylcytosine/motIf/Fragmentation/nucleosomefootprInt)
发表杂志：CELLRESEARCH
实验设计：
肝细胞癌(HCC)是全球第二大致命性癌症。肝硬化患者易发生肝癌，肝癌的年发病率增加2%--4%。肝硬化的发展促进一系列遗传或表观遗传改变，导致发育不良结节的形成，这是肝癌的癌前阶段。早期诊断肝癌有助于改善预后和治疗的可能性。由于目前诊断方法的准确性较低，因此迫切需要探索新的非侵入性肝癌早期诊断策略。因此，作者将来自中国11个省13家医院的名肝硬化(LC)患者、名肝癌患者和名健康对照组(CTRL)的细胞游离DNA(cfDNA)样本，随机分配到培训、验证和测试队列，以开发和评估诊断模型。作者采用了5-hmc，核小体足迹分析，cfDNA5’端motif和片段大小分析检测了所有入组的样本。基于这四个特征的性能，作者构造了一个加权诊断模型。根据作者的排除标准，共有人最终被纳入作者的研究，并随机分配到训练/验证/测试队列。来自13家医院的例LC患者中位年龄56岁，男性占76%，83.3%为HBV感染，Child-Pugh评分A、B、C80.9%，15.8%，0.2%。例HCC患者中位年龄为51岁，87.5%为男性，79%为HBV感染，64%为LC,BCLC0/A期和B/C期患者分别占41.8%和58.2%。岁CTRL的中位年龄是54岁，46.4%为男性，无一例有慢性肝炎病毒感染、LC或HCC病史。分析个体基因特征，以确定它们在区分HCC、LC和CTRL中的相关性。作者在HCC和CTRL中发现了不同的5-hmc修饰。NF分析表明，差异基因的reads覆盖率具有区分CTRL和肝癌能力。与此同时,个末端motif模式也显示为HCC与CTRL的潜在分类参数。此外，作者的数据显示cfDNA的碎片大小肝细胞癌变异更大且更短(中位大小bp)。总的来说，这四个特征都显示出对HCC有很好的诊断潜力。而LC与CTRL有很大不同，明显增加了诊断难度。通过整合上述四个基因组特征，HIFI方法展示了一个强大的区分HCC和LC的诊断价值,在验证集(95例HCC和例LC)敏感性为95.79%,特异性为95.00%，测试集敏感性为95.42%,特异性97.83%(例HCC和例LC)。HIFI对HCC和LC的鉴别能力(验证:AUC=0.[0.-1.]，测试集:AUC=0.[0.-0.])优于AFP(验证集:AUC=0.(0.--0.),测试集:AUC=0.(0.--0.))。此外，HIFI在从非HCC(LC+CTRL)和CTRL中区分HCC的鉴别诊断方面也取得了良好的表现。在区分HCC和LC时，NF是最好的个体诊断特征，验证集(AUC=0.)[0.-0.])和测试集(AUC=0.[0.-0.])，但仍低于HIFI方法(验证集，AUC=0.)(0.--1.);测试集，AUC=0.[0.-0.])。此外，剩下的三个基因组特征比AFP表现得更好(验证集，AUC=0.[0.-0.];测试集，AUC=0.[0.-0.])。HIFI在区分HCC、非HCC或CTRL时，其诊断能力优于个体基因组特征。为了获得最佳模型，作者尝试了不同的基因组特征组合，并评估了它们的诊断能力。结果表明HIFI优于任何基因组特征的组合。此外，HIFI方法在5例5hmc误诊病例中也取得了较高的准确率。在作者之前发表的研究中，以32个主要来源于基因体的5-hmc标记计算的wd-score在HCC中具有较强的诊断能力。为此，作者分别在作者的验证和测试集(HCC和非HCC)中评估了其诊断潜力，结果显示其诊断准确性低于HIFI评分。cfDNA浓度在个体间存在差异，HCC组最高。为了测试临床应用的可行性，作者随后评估了同一HCC/LC样本在一系列DNA投入量(1、2、5、10ng)和不同批次(不同的技术人员和试剂批次)中的5hmc-seq/全基因组测序(WGS)数据的一致性，并观察到高相关性(平均皮尔逊r0.9)表明作者的5hmc-seq/low-passWGS的稳健性和可行性，以及临床应用的可行性。此外，HIFI方法的诊断性能不受cfDNA浓度的影响，尽管低cfDNA浓度(10ng/mL)的LC患者的片段长度明显更长。例LC患者来自中国11个不同的省份。为了检验地理分布可能造成的偏差，作者基于样本来源重建了11个独立的测试集(医院4、9和10被整合到一个集合中)，并评估了每个基因组特征的表现。NF在11组测试中表现稳定，AUC为0.97。Motif医院也表现出较高的诊断能力。5-hmc的诊断能力随AUC取值范围为0.[0.-0.]至0.(0.--0.)。同时碎片化也取得了很好的分类性能，医院的AUC值都超过了0.。HIFI方法在所有11组测试中均表现出较高的诊断准确率和良好的表现(AUC0.99，准确度99%)。这表明无论人口分布如何，HIFI方法在临床应用中都是稳定和稳健的。总体来看，HIFI评分从CTRL到HCC有逐渐升高的趋势，在LC队列中，有无腹水患者HIFI评分差异有统计学意义(P=0.)。而与Child-Pugh分期(AvsB+C,P=3.e-05)、总胆红素水平(34μmol/Lvs≥34μmol/L,P=0.)呈负相关、白蛋白水平(35vs≤35,P=0.2762)与血小板水平呈正相关(K/mLvs-K/mL,P=0.)。在HCC队列中，肿瘤大小越大(5cm,P=2.e-05)、PIVKA-II水平越高(40,P=0.)的患者HIFI评分明显越高。有肝硬化史的HCC患者HIFI评分明显高于无肝硬化史的HCC患者(P=0.)。在评估HIFI方法对LC患者亚组的诊断价值时，在可能被误诊为HCC的AFP阳性患者中，HIFI方法具有较高的准确性(例患者中例为20AFPμg/L,96.3%;AFPμg/L患者16例，%)：HIFI法也能准确区分AFP阴性的HCC和LC。此外，无论LC患者的年龄、Child-Pugh分期和HBV感染状态如何，HIFI方法均显示出一致和更高的准确性。而LC合并糖尿病和高血压患者HIFI方法的准确率略低(χ2检验，Pdiabetes=0.,Phypertension=0.)，这是HCC的易发因素。在HCCs中，HIFI方法对AFP阴性的患者(98例中92，93.9%)和PIVKA-ii阴性患者(33例中30例，90.9%)均获得了较高的诊断准确率。HIFI方法的准确性与年龄、肝硬化史和HBV感染状态无关，在任何HCC患者亚组中均优于AFP和PIVKA-II。最重要的是，HIFI方法对早期HCC的检测是强大的(BCLC:A，94.4%/AJCC:I,94.7%)，甚至非常早期的HCC(BCLC:0，88.9%)。AFP/PIVKA-II及个体特征对早期HCC的诊断准确率明显低于HIFI。AFP/PIVKA-II联合HIFI并不能进一步提高诊断的准确性。HIFI在诊断小肿块方面表现良好HCC(直径3cm,96.7%)，AFP和PIVKA-II与肿瘤大小呈正相关。在AFP/PIVKA-II型肝癌误诊病例中，HIFI准确率较高(93.9%/90.9%)。人类基因组的5-hmc修饰影响基因表达活性，而NF作为cfDNA片段组学中的一种，则反映转录起始和延伸。在作者的研究中，作者发现多种5-hmc和NF标记物在HCC中强烈富集。另外两个片段组学标记，末端基序和携带起源组织信息的片段大小，也被纳入HIFI方法。然而，它们在肝癌发生中的潜在机制有待进一步研究。综上所述，基于cfDNA独特的基因组特征，作者进行了大规模、多中心的研究，并开发了一种新的完整的HCC诊断方法。HIFI方法在鉴别HCC与LC和CTRL组(包括AFP/PIVKA-ii阴性的HCC)之间具有较高的准确性，这进一步证明HIFI方法作为HCC早期诊断和监测的新策略具有很大的潜力。HIFI技术满足了早期肝癌的鉴别和治疗的迫切需要。然而，作者的研究也有一些局限性。本研究的患者均来自中国，因此HIFI方法诊断其他种族的HCC还需要更多的研究。第二，由于作者的主要目的是区分HCC和LC，所以CTRL在测试集中的数量较少。因此，HIFI在健康对照组也表现良好的结论还需要在更大的队列中进一步证明。综合考虑其准确性高、无创性和普适性，HIFI方法在高危人群的公共健康筛查中有很大的潜力，特别是当HCC影像学筛查所需的设备和基础设施都无法获得时。参考文献：1.ChenL,Abou-AlfaGK,ZhengB,LiuJF,BaiJ,DuLT,QianYS,FanR,LiuXL,WuLetal:Genome-scaleprofilingofcirculatingcell-freeDNAsignaturesforearlydetectionofhepatocellularcarcinomaincirrhoticpatients.CellRes.阅读笔记：5-hmc测序：用5-20ngDNA构建测序文库。将DNA样本进行末端修复/dA-tailing(5倍ER/A-taile酶混合物)和接头连接酶(WGS连接酶)。该接头序列是专门为IlluminaNovaSeq6平台设计的。连接的DNA在含有50mMHEPES缓冲液(pH8)、25mMMgCl2、60μMUDP-6-N3-Glc(ActiveMotif，美国)和12.5UβGT的25μl溶液中孵育(Thermo，美国)在37°C下作用2小时。直接加入2.5μlDBCOPEG4-生物素(ClickChemistryTools,USA)，37℃孵育2h。纯化后的DNA与0.5μlM链霉亲和素珠(LifeTechnologies,USA)在缓冲液1(5mMTrispH7.5,0.5mM，EDTA,1MNaCl和0.2%Tween20)中用鲑鱼精子DNA预先阻断30min，用SA-beads捕获含有5-hmc特征的DNA片段，在IlluminaNovaSeq6平台上检测。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇